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PREDIZIONE DEL TITOLO VIRALE IN UN PROCESSO INDUSTRIALE DI PRODUZIONE DI REOVIRUS IMPIEGATI PER LA FORMULAZIONE DI VACCINI AVIARI

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA INDUSTRIALE CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN INGEGNERIA CHIMICA E DEI PROCESSI INDUSTRIALI Tesi di Laurea Magistrale in Ingegneria Chimica e dei
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA INDUSTRIALE CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN INGEGNERIA CHIMICA E DEI PROCESSI INDUSTRIALI Tesi di Laurea Magistrale in Ingegneria Chimica e dei Processi Industriali PREDIZIONE DEL TITOLO VIRALE IN UN PROCESSO INDUSTRIALE DI PRODUZIONE DI REOVIRUS IMPIEGATI PER LA FORMULAZIONE DI VACCINI AVIARI Relatore: Prof. Massimiliano Barolo Correlatori: Dott.ssa Donatella Bernini Ing. Martina Largoni Laureando: RICCARDO VEDOLIN ANNO ACCADEMICO Riassunto In questa Tesi è affrontato il problema del monitoraggio in tempo reale di un processo biologico-farmaceutico per la produzione di reovirus impiegati per la formulazione di vaccini aviari. Il processo in esame viene condotto mediante fermentazioni batch, al termine delle quali si ottiene un prodotto di qualità variabile. Nella Tesi vengono sviluppati dei modelli basati su dati, che permettono di stimare la qualità finale del prodotto a partire dai dati di processo disponibili. I modelli sono stati costruiti in modo da fornire la stima del titolo virale finale alla conclusione del batch, riducendo così il tempo di attesa rispetto a quanto ad oggi avviene grazie ai test del laboratorio interno, che rendono noto il valore del titolo 15 giorni dopo la conclusione del batch. I modelli sviluppati sono stati ottimizzati in modo da predire, con sufficiente accuratezza, la qualità finale sia di batch in specifica che di batch fuori specifica. I risultati ottenuti in termini di stima sono positivi e mostrano come il titolo possa essere predetto, in maniera affidabile, con un errore mediamente inferiore rispetto a quello compiuto dalle analisi di laboratorio, sia per i batch in specifica sia per i batch fuori specifica. In particolare, realizzando in tempo reale la stima del titolo virale finale, i modelli sviluppati permettono di stimare con precisione il titolo virale finale a partire dalla 30 a ora di fermentazione, cioè da circa metà della durata di ciascun batch. Indice INTRODUZIONE... 1 CAPITOLO 1 Processo per la produzione di reovirus DESCRIZIONE DEL PROCESSO Stadio di raccolta e pretrattamento delle uova Stadio di digestione Stadio di fermentazione DATI DISPONIBILI DESCRIZIONE DEL FERMENTATORE DA 300 L Analisi del sistema di controllo Controllo della velocità d agitazione Controllo della pressione del reattore Controllo della concentrazione di O 2 disciolto e della portata d aria Controllo del ph Controllo della temperatura Legge di controllo e sintonizzazione del regolatore PI DESCRIZIONE DEL FERMENTATORE DA 600 L Analisi del sistema di controllo CAPITOLO 2 Richiami statistici sul metodo PLS LA QUALITÀ NEI PROCESSI BATCH METODO DELLA PROIEZIONE SU STRUTTURE LATENTI Teoria del metodo PLS Calibrazione e convalida Trattamento preliminare dei dati Statistiche di controllo Statistica SPE Statistica T Selezione del numero di variabili latenti Selezione delle variabili: indice VIP Predizione della qualità finale in processi batch Unfolding... 27 Predizione del parametro di qualità in tempo reale CAPITOLO 3 Stima del titolo virale finale SVILUPPO DELLA METODOLOGIA DI LAVORO RELAZIONE TRA IL TITOLO FINALE E LE VARIABILI INIZIALI PER BATCH IN SPECIFICA PREDIZIONE DEL TITOLO FINALE DALLE VARIABILI DI FERMENTAZIONE PER BATCH IN SPECIFICA Predizione del titolo finale nel fermentatore da 300 L Selezione delle variabili di fermentazione Selezione delle numero di variabili latenti Analisi delle segnalazioni di non rappresentatività Predizione del titolo finale con il modello ottimizzato Confronto fra modelli PLS lineari e non lineari con il modello ottimizzato Predizione del titolo finale in tempo reale con il modello ottimizzato Predizione del titolo finale nel fermentatore da 600 L Selezione delle variabili di fermentazione Selezione delle numero di variabili latenti Analisi delle segnalazioni di non rappresentatività Predizione del titolo finale con il modello ottimizzato Confronto fra modelli PLS lineari e non lineari con il modello ottimizzato Predizione del titolo finale in tempo reale con il modello ottimizzato Conclusioni sulla predizione del titolo finale con batch in specifica PREDIZIONE CON BATCH IN E FUORI SPECIFICA Predizione del titolo finale dei batch del reattore da 600 L Selezione delle variabili di fermentazione per un modello sui batch fuori specifica Scelta del numero di variabili latenti per un modello sui batch fuori specifica Prestazioni del modello locale Predizione del titolo finale in tempo reale con il modello locale Predizione del titolo finale dei batch del reattore da 300 L Conclusioni sulla predizione del titolo finale dei batch in e fuori specifica CONCLUSIONI APPENDICE A.1 FIGURE DEL CAPITOLO A.2 FIGURE DEL CAPITOLO A.3 FIGURE DEL CAPITOLO A.4 CODICI DI CALCOLO NOMENCLATURA RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI... 81 Introduzione Nelle produzioni industriali è importante monitorare la qualità del prodotto finale. Essa, infatti, può essere soggetta a variabilità, per esempio dovuta alle materie prime o alle diverse condizioni alle quali viene esercito il processo. Accade piuttosto di frequente che, nonostante in ciascuna produzione si conducano le medesime azioni e si cerchi di garantire le stesse condizioni di processo (lavorazione secondo ricetta ), la qualità del prodotto vari, comportando talvolta dei fuori specifica. Questo problema è particolarmente rilevante nell industria farmaceutica, nella quale le specifiche di produzione sono molto restrittive (per effetto dei vincoli regolatori) e i prodotti hanno alto valore aggiunto. In questa Tesi si studia un processo biologico-farmaceutico per la produzione di reovirus utilizzati nella formulazione di vaccini aviari. Il processo viene condotto nell azienda Merial Italia S.p.A. di Noventa Padovana. Il problema affrontato è la variabilità della qualità del prodotto, rappresentata dal titolo virale finale del reovirus, che può comportare l ottenimento di un prodotto fuori specifica. Il titolo virale finale viene determinato mediante analisi di laboratorio, il cui esito è noto solo 15 giorni dopo il termine del batch. L obiettivo perseguito nella Tesi è sviluppare dei modelli che, a partire dai dati di processo disponibili, permettano di predire il titolo virale finale riducendo l attesa dovuta ai tempi necessari per lo svolgimento delle analisi di laboratorio. Nonostante prove per definire le condizioni sperimentali più appropriate per la crescita del reovirus siano note in letteratura (Robertson e Wilcox, 1986; Grande e Benavente, 2000), la produzione industriale di reovirus ha finora solo marginalmente beneficiato di queste informazioni e la maggior parte delle operazioni viene svolta sulla base dell esperienza. La complessa gestione del processo rende necessario uno studio approfondito, basato sull implementazione di opportuni metodi statistici per estrarre dai dati informazioni che permettano una migliore comprensione del processo produttivo. Nella Tesi vengono condotte quattro principali attività: organizzazione razionale e trattamento dei dati dell intero processo produttivo; elaborazione di una metodologia per individuare le attività che possono essere condotte per migliorare il monitoraggio di processo e, in particolare, sviluppo dell attività legata alla stima della qualità del prodotto; analisi preliminare su tutte le variabili di processo per definire le operazioni rilevanti e significative per la definizione della qualità del prodotto; analisi dettagliata dello stadio di fermentazione, dove avviene la replicazione del virus. Per legare i dati di processo disponibili alla variabile di qualità al fine di predirla, si utilizza il metodo statistico multivariato PLS (partial least squares regression, Geladi e Kowalski, 2 Introduzione 1986). Viene sviluppato un sensore virtuale (soft sensor) che, tramite modelli PLS, permette di predire il titolo virale finale del reovirus. Finora i metodi di soft sensing hanno trovato poche applicazioni in ambiti legati alla biotecnologia (Mandenius e Gustavsson, 2014), e in questa Tesi per la prima volta viene applicato il soft sensing ad un processo di produzione di reovirus. La predizione del titolo finale viene eseguita a batch concluso, al fine di predire il titolo dei batch in anticipo rispetto alle lunghe analisi di laboratorio. Nella Tesi viene anche discussa la possibilità di predire in tempo reale il titolo finale, permettendo, nel caso di batch che stiano evolvendo verso condizioni di fuori specifica, di intervenire con azioni correttive. La Tesi si sviluppa su 3 capitoli. Nel Capitolo 1 viene descritto il processo per la produzione di reovirus, presentando i dati di processo disponibili. Nel Capitolo 2 viene spiegata la tecnica statistica multivariata utilizzata per la predizione della qualità del prodotto. Il Capitolo 3 descrive la metodologia utilizzata per realizzare la stima del titolo finale; vengono riportate, dopo un analisi preliminare sulle variabili iniziali di processo, le prestazioni di predizione ottenute dai modelli che utilizzano i dati relativi alla fermentazione, a seconda che il modello sia sviluppato su dati di batch in specifica o si considerino anche i dati dei batch fuori specifica. Una sezione finale riassume le conclusioni che possono essere tratte dal lavoro svolto. Capitolo 1 Processo per la produzione di reovirus In questo Capitolo viene descritto il processo per la produzione di reovirus dell azienda Merial di Noventa Padovana. Il processo è l oggetto di studio della Tesi al quale si applicano tecniche di analisi statistica multivariata al fine di monitorarne lo stato. Vengono descritti i dati a disposizione e particolare attenzione inoltre viene data alla descrizione del fermentatore e del sistema di regolazione. 1.1 Descrizione del processo Un reovirus è l antigene virale che viene utilizzato nei vaccini aviari contro le artriti. Il processo Merial ha lo scopo di produrre tale virus, con una ben determinata specifica di titolo infettante sul prodotto finale. Esso deve risultare infatti superiore ad un certo valore di soglia. Il titolo virale finale è espresso come concentrazione quindi e rappresenta la capacità infettante del virus, cioè il suo potere di moltiplicarsi all interno delle cellule. Il processo si sviluppa in tre stadi principali: raccolta e pretrattamento delle uova, digestione e fermentazione. La materia prima di partenza è l uovo di pollo a 11 giorni di vita. In Figura 1.1 viene riportato lo schema a blocchi del processo, articolato nei 3 stadi. Lo schema è strutturato secondo 3 livelli. In particolare vengono specificati all interno di ogni stadio i materiali usati, le operazioni coinvolte e i dati raccolti. Questa tipologia di struttura viene utilizzata seguendo lo schema logico proposto da Tomba et al. (2013). 4 Capitolo 1 Figura 1.1.vsd Figura 1.1. Schema a blocchi del processo Merial per la produzione di reovirus. Processo per la produzione di reovirus 5 Nei paragrafi successivi è presente la descrizione dettagliata delle operazioni presenti all interno di ciascuno dei 3 stadi Stadio di raccolta e pretrattamento delle uova Lo stadio di raccolta è strutturato secondo diverse fasi che qui vengono descritte facendo riferimento alla Figura 1.1. Le uova vengono consegnate dal fornitore dopo aver subito una serie di trattamenti. In particolare, vengono tenute in incubazione per un periodo di tempo osservato, poi vengono disinfettate e sottoposte a speratura 1. Successivamente, vengono caricate su camion e trasportate fino all azienda. Le uova consegnate subiscono una prima operazione di disinfezione in una camera in cui viene nebulizzato un disinfettante con lo scopo di abbassare la carica batterica che è normalmente presente nel guscio delle uova. Dopo il trattamento, le uova disinfettate subiscono l operazione meccanica del taglio della calotta superiore del guscio, guidata da un operatore specializzato. Eliminato il guscio, è possibile estrarre l embrione contenuto all interno dell uovo. Questa operazione viene eseguita manualmente, con l ausilio di pinzette, da parte di 2 addetti. L operazione di estrazione è molto delicata perché si deve estrarre l embrione separandolo nel miglior modo possibile dalla parte restante dell uovo. Gli embrioni vengono poi posti in 14 apposite beute in vetro in modo che ciascuna beuta contenga circa embrioni. In questa fase alcune uova vengono scartate, o per problemi di rottura del guscio durante il taglio o perché gli embrioni sono morti. La percentuale di scarto rappresenta un dato di processo. Quando ogni beuta è stata riempita, viene passata alla fase successiva attraverso un locale di disinfezione. Per ogni beuta vengono effettuati 2 lavaggi a temperatura ambiente con una soluzione salina fisiologica (PBS, phosphate buffered saline) con lo scopo di eliminare le impurità delle uova presenti nelle beute, dovute alle operazioni precedenti. In particolare ogni beuta viene mantenuta in lenta agitazione per 2 minuti. Successivamente, si attende qualche istante affinché gli embrioni possano sedimentarsi sul fondo. Infine, si svuota manualmente la soluzione di lavaggio contenente la sporcizia avendo cura di non far fuoriuscire gli embrioni. 1 La speratura è l operazione che consiste nell osservazione di un uovo controluce mediante una lampada sperauovo. Viene effettuata in incubatoio per verificare che le uova da cova siano fertili e con embrione vitale, al nono o decimo giorno di incubazione. 6 Capitolo Stadio di digestione Dopo le operazioni iniziali, gli embrioni vengono trattati per estrarre le cellule (fibroblasti di pollo) che saranno utilizzate per la crescita del virus nel successivo stadio di fermentazione. Si passa, quindi, allo stadio di digestione vero e proprio. In ogni beuta viene immessa una soluzione costituita da PBS e pronase, un enzima che serve a favorire la disgregazione delle cellule degli embrioni. Il sistema viene lasciato in agitazione a bassa intensità per 20 min a 41 C, temperatura alla quale l enzima si attiva. Tale temperatura viene mantenuta grazie ad un bagno ad acqua nel quale è inserita la beuta. La digestione viene ripetuta per 2 volte. Già alla fine del primo ciclo, e ancor più chiaramente alla fine del secondo, è possibile osservare come nella beuta siano presenti 2 fasi nettamente separate: il liquido costituito da cellule disgregate e soluzione di PBS, e lo strato al fondo, costituito principalmente da impurità e parti di embrione non disgregate da eliminare. Al termine di ciascuna delle digestioni, dopo aver atteso qualche secondo per far sedimentare lo strato di impurità, viene eseguito il prelievo della fase liquida. Più di metà del liquido contenuto in ogni beuta viene inviato in una tanica mediante un ago aspirante collegato ad una pompa, passando attraverso un sacchetto filtrante con setto poroso per trattenere le impurità residue e lasciar passare il prodotto desiderato. Il prodotto viene successivamente trasferito in barattoli per centrifuga da 1 L. Lo stadio di centrifugazione serve per separare lo strato di cellule, che si ritroveranno adese al fondo di ogni flacone, dal surnatante costituito da soluzione di PBS, che viene eliminato manualmente. Dopo aver tolto il surnatante, ad ogni flacone viene aggiunto il terreno di coltura, costituito da Earle (un composto di sali di vario tipo), bicarbonato e acqua. Ogni flacone viene agitato in modo che le cellule vengano messe in sospensione col terreno di coltura, dove esse mantengono le loro funzioni vitali. La sospensione poi viene inviata ad una tanica passando attraverso una garza filtrante per trattenere le ultime impurità. Si sottolinea che la fase di digestione determina variabilità Stadio di fermentazione La tanica che arriva dallo stadio di digestione viene mantenuta a temperatura ambiente e in lenta agitazione per evitare che le cellule aderiscano tra loro. In questa fase viene prelevato un campione di circa 5 ml, che viene utilizzato per la conta cellulare. La conta delle cellule è importante perché il fermentatore contiene una quantità di terreno che permette la sopravvivenza di cellule. Tramite una metodologia sperimentale con camera di burker viene fatto il conteggio delle cellule per ml. Poi viene utilizzata l Equazione (1.1) al fine di determinare il numero di cellule per ml di terreno di fermentatore: Processo per la produzione di reovirus 7 n cellule n cellulecontate 1000 volume = mlterreno volume fermentato re fermentatore tanica. (1.1) In base al numero di cellule contenute nella tanica si verifica che tale numero sia adeguato al fine di permettere che la fermentazione possa avvenire nelle migliori condizioni. Il numero di cellule contenute nella tanica è un valore piuttosto indicativo, poiché la misura è poco precisa, ma l intervallo di errore tollerato è piuttosto ampio. Nella tanica, in agitazione e a temperatura ambiente, viene iniettata una piccola quantità di virus che andrà ad infettare le cellule, per poi moltiplicarsi all interno del fermentatore. Il rapporto tra la quantità di virus introdotto (legato al titolo del virus, noto da prove di laboratorio) e il numero di cellule è legato ad un coefficiente adimensionale, detto MOI (multiplicity of infection). Esso in particolare viene definito biologicamente come: MOI titolo virale = matrice 1mLmatricevirale. (1.2) n cellule 1mLterreno fermentatore volume volume fermentatore Si utilizzano delle matrici di virus standard e si mantiene un MOI costante per ogni produzione. Prima di alimentare al fermentatore le cellule con il virus vengono effettuati due cicli di sterilizzazione. Il primo è una sterilizzazione a vuoto con vapore, mirata principalmente a sterilizzare la valvola di fondo. Poi viene effettuato il carico di acqua di osmosi purificata nel reattore per la seconda sterilizzazione a pieno. Tra i due cicli vengono tarati i sensori di O 2 e ph dell impianto. Terminati i cicli di sterilizzazione, nel fermentatore viene caricato un medium contenente Earle e TPB (anticoagulante acido e nutriente). Quindi, viene trasferito al bioreattore l inoculo (sospensione cellulare e virus), grazie ad una pompa peristaltica e attraverso una linea sterilizzata. Durante la fermentazione si mantengono controllati i parametri di processo, cioè il ph, la temperatura e la percentuale di ossigeno. In queste condizioni, ottimali, la fermentazione continua per 61 h circa. I profili tipici della percentuale di ossigeno disciolto e del ph sono riportati in Figura 1.2. 8 Capitolo 1 O 2 disciolto (%) ph Figura 1.2a e Figura 1.2b.opj tempo (ore) tempo (ore) (a) (b) Figura 1.2. Andamento tipico (a) della percentuale di ossigeno disciolto e (b) del ph in funzione del tempo di fermentazione. Nei primi istanti la percentuale di ossigeno disciolto è quasi pari a 100%. Poi, come si può osservare dalla Figura 1.2a, essa cala drasticamente a causa della respirazione cellulare fino ad attestarsi attorno al set point, tipicamente fino alla fine del batch. Il periodo di tempo in cui le cellule respirano è denominata fase aerobia. In una prima fase della fermentazione viene a crearsi un ambiente acido, che deve essere regolato con l immissione di bicarbonato. In una seconda fase, le cellule cominciano a morire a causa del moltiplicarsi del virus al loro interno. La loro morte crea un ambiente ossidante che fa aumentare il ph. L ambiente a questo punto diventa basico e deve essere regolato impiegando CO 2. A prova di questo fenomeno è presentato l andamento del ph in Figura 1.2b: il ph cresce fino alla dodicesima ora circa e poi si attesta attorno al valore di set point. Durante la seconda fase l aria serve sempre meno e meno frequentemente poiché le cellule stanno morendo a causa del moltiplicarsi del virus infettante al loro interno. L andamento tipico della portata d aria è pertanto quello riportato in Figura 1.3. Processo per la produzione di reovirus 9 portata d'aria (NL/min) Figura 1.3.opj tempo (ore) Figura 1.3. Andamento tipico della portata d aria in funzione del tempo di fermentazione. Al termine dell ul
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