Please download to get full document.

View again

of 14
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.

ПАТОБИОХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 2,3,7,8-ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-П-ДИОКСИНА (ТХДД) 2000 г., д. м. н. В.Р. Рембовский

Category:

Maps

Publish on:

Views: 0 | Pages: 14

Extension: PDF | Download: 0

Share
Related documents
Description
УДК 625.9: ПАТОБИОХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 2,3,7,8-ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-П-ДИОКСИНА () 2 г., д. м. н. В.Р. Рембовский Действительный член Академии Военных Наук к. м. н. С.П. Кречетов,
Transcript
УДК 625.9: ПАТОБИОХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 2,3,7,8-ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-П-ДИОКСИНА () 2 г., д. м. н. В.Р. Рембовский Действительный член Академии Военных Наук к. м. н. С.П. Кречетов, В.М. Геращенко Исследовано влияние воздействия в дозах, близких к среднесмертельным, на протекание перекисного окисления липидов, состояние цитохром Р-45-содержащей ОСФ, обмен активных форм кислорода и глутатиона в печени лабораторных млекопитающих разных видов. Обосновывается, что причиной интенсификации перекисного окисления липидов при интоксикации, может быть нарушение равновесия в продуцировании и утилизации активных форм кислорода цитохромом Р-45. Образующийся в ряде технологий уничтожения химического оружия 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (, диоксин) является наиболее токсичным представителем полигалогенированных дибензо-п-диоксинов [1] и опасным загрязнителем окружающей среды [2]. Его действие на организм характеризуется широким спектром биохимических проявлений, включающих индукцию ряда ферментов (цитохром Р-45-содержащей оксидазы со смешанными функциями (ОСФ), ДТдиафоразы, синтетазы δ-амино-левулиновой кислоты, УДФ-глюкуронилтрансферазы, глутатион-s-трансферазы), изменение показателей липидного и углеводного обменов [4, 5, 6, 7]. Среди причин необратимого повреждения клетки при интоксикации диоксином наибольший интерес представляют нарушения, обусловленные интенсификацией перекисного окисления липидов (ПОЛ). С одной стороны, интенсификация этого процесса действительно отмечается при введении [6, 8, 9]. С другой стороны, наиболее выраженный биохимический сдвиг в организме происходит в системе цитохрома Р-45, функционирование которого, так же, как и связанной с ним НАДФ Нцитохром Р-45-редуктазы, сопровождается генерацией супероксиданиона и перекиси водорода [1, 11] - активных форм кислорода (АФК), способных инициировать ПОЛ [12]. В соответствии с изложенным исследования состояния про- и антиоксидантных систем при интоксикации диоксином представляют собой перспективное направление в раскрытии механизма токсического действия данного ксенобиотика. Имеющиеся литературные данные указывают на вовлечение указанных процессов не только в патогенез поражения [9, 13], но и, возможно, в формирование различий по чувствительности к [8]. Опыты проводили на клинически здоровых половозрелых животных. В экспериментах использовали мышей гибридов (C57BL/6хDBA/2)F1 массой г, крыс белых нелинейных массой г, морских свинок нелинейных массой г, кроликов породы шиншилла массой г. В каждой экспериментальной группе соотношение самок и самцов было 1:1. и 3-метилхолантрен вводили в оливковом масле из расчета 1 мл раствора на кг массы тела. Доза составляла для крыс 1, мг кг -1, для морских свинок -,1 мг кг -1, для кроликов,3 мг кг -1, для мышей -,2 мг кг -1, что соответствует LD 2...LD 8 (дозам, вероятность смертельного исхода при воздействии в которых составляет,2...,8) для данных видов и линий. Доза 3-метилхолантрена составляла 25 мг кг -1 сутки -1. Фенобарбитал вводили в физиологическом растворе из расчета 2 мл на кг массы тела в дозе 7 мг кг -1 сутки -1. Все индукторы вводили внутрибрюшинно. вводили однократно, метилхолантрен - дважды с интервалом в сутки и забоем на третьи, а фенобарбитал - трижды с интервалом в сутки и забоем на четвертые. 149 Рис. 1. Влияние воздействия в среднесмертельной дозе на ПОЛ в печени млекопитающих. - аскорбат-зависимое ПОЛ, - НАДФ Н-зависимое ПОЛ в митохондриях, 2. - в микросомах..1 - морская свинка,.2 - крыса нелинейная,.3 - кролик шиншила,.4 - мышь (C57Bl/6xDBA/2)/F1. Данные представлены в виде средних ± ошибки средних, деленных на среднее в группе контроля влияния растворителя. Звездочкой помечены достоверные отличия от этого контроля (Р .5). Животных забивали декапитацией. митохондрий и микросом оценивали по Получение сыворотки крови и выделение накоплению малонового диальдегида (МДА) фракций гомогената печени проводили по при активации аскорбатом и стандартным методикам [14]. восстановленным никотинамидадениндинуклеотидфосфатом Интенсивность ПОЛ в образцах (НАДФ Н) [15]. интенсивность образования супероксиданиона,% интенсивность образования супероксиданиона,% интенсивность образования супероксиданиона,% интенсивность образования перекиси водорода,% интенсивность образования перекиси водорода,% интенсивность образования перекиси водорода,% Рис. 2. Влияние воздействия в среднесмертельной дозе на образование АФК в микросомах печени млекопитающих..1 - морская свинка,.2 - крыса нелинейная,.3 - мышь (C57Bl/6xDBA/2)/F1. Данные представлены так же, как на рис Количество цитохрома Р-45 [19]. Образование перекиси водорода (КФ ) в образцах микросом печени микросомами печени измеряли с помощью определяли по количеству комплекса восстановленного тиоцианатного метода [2]. цитохрома с окисью Суммарное содержание глутатиона в углерода [16]. Активность цитохром Р45- гомогенате печени определяли с использованием редуктазы (КФ ) измеряли по восстановлению реактива Элмана [21]. Активность цитохрома c [17]. Оценку глутатионредуктазы (КФ ) активности гидроксилазы ароматических определяли по убыли НАДФ Н [22]. Глутатион-S-трансферазную углеводородов (КФ ) в микросомах активность проводили по образованию 3-оксибензпирена [18]. Генерация супероксиданиона микросомами печени оценивалась по восстановлению адреналина в адренохром [11]. Активность супероксиддисмутазы (КФ ) характеризовали по ее способности ингибировать автоокисление адреналина в адренохром в щелочной среде (КФ ) оценивали по катализируемому этим ферментом образованию коньюгата восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом [23]. Определение белка во фракциях гомогената печени проводили по методу Лоури [24]. Содержание общих липидов, фосфолипидов, триглицеридов, холестерина и β-липопротеидов в сыворотке крови цитохрома Р-45, % цитохрома Р-45, % активность цитохром Р-45 редуктазы, % активность цитохром Р-45 редуктазы, % активность ГАУ, % активность ГАУ, % Рис. 3. Влияние воздействия в среднесмертельной дозе на параметры функционирования цитохром Р-45-содержащей ОСФ и активность эпоксидгидратазы в микросомах печени млекопитающих морская свинка, 2. - крыса нелинейная. Данные представлены так же, как на рис измеряли с использованием стандартных существенное снижение этого показателя в клинико-лабораторных методик микросомах печени на сутки после [25, 26, 27, 28, 29]. введения, а у морских свинок и Приводимые данные получали на мышей наблюдается его повышение на экспериментальных группах из сутки животных. Достоверность различий Результаты исследований состояния между результатами измерений оценивали компонентов цитохром Р-45-содержащей с помощью t-критерия Стьюдента для ОСФ при действии (рис. 3 и табл. 1) непарных измерений. показали, что имеют место незначительные Проведенные эксперименты показали, изменения активности цитохром Р-45- что у млекопитающих разных видов редуктазы при существенных изменениях после введения в дозах, близких к состояния цитохрома Р-45, среднесмертельным, в печени наблюдается выражающихся в изменениях его интенсификация ПОЛ (рис. 1). У крыс спектральных характеристик, росте увеличение образования МДА имеет достоверную абсолютного содержания цитохрома и бенззависимого величину для НАДФНпиренгидроксилазной активности. ПОЛ на 1 сутки, и наиболее Спектральный сдвиг в дифференциальном стабильное увеличение этого показателя спектре поглощения восстановленного наблюдается в микросомах, где оно достоверно комплекса цитохрома Р-45 с окисью на все сроки обследования. Для углерода выражается в смещении располо- аскорбат-зависимого ПОЛ, как в микросомах, женного около 45 нм максимума в так и в митохондриях, коротковолновую область (табл. 1), что интенсификация имеет менее выраженный наиболее характерно для индукторов метилхолантренового характер. У морских свинок изменение типа [3]. Указанное накопления МДА в пробах более устойчиво. смещение спектра может отражать Начиная с суток, наблюда- возрастание пероксидазных свойств у ин- ется увеличение интенсивности НАДФ Нзависимого и аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомах. Несколько позднее, с 14 суток, эти же показатели увеличиваются в митохондриях. Аналогичные изменения имеют место и для кроликов, у которых в микросомах эта интенсификация заметна на 3 сутки, а в митохондриях - после 14 суток. У мышей (С57Вl/6 DBA/2)F1 не отмечалось существенных изменений ПОЛ при введении. Лишь на 3 сутки имела место более высокая интенсивность образования МДА в системе с аскорбатом, как в микросомах, так и в митохондриях. Оценка продуцирования АФК, как важнейшего прооксидантного фактора клетки, выявила (рис. 2), что при интоксикации у всех исследовавшихся биообъектов в микросомах печени на 3 сутки наблюдается некоторое снижение образования супероксиданиона, затем, начиная с 14 суток, сменяющееся увеличением, сохраняющимся, по крайней мере, в течение еще недель. Изменение выхода перекиси водорода характеризуется обратными тенденциями. Так, у крыс и морских свинок имеет место дуцируемых форм цитохрома, поскольку максимумы поглощения восстановленных комплексов с окисью углерода у каталазы и пероксидаз лежат в еще более коротковолновой области, около 42 нм. Tаблица 1 Влияние стандартных индукторов и на положение максимума в дифференциальном спектре поглощения восстановленного комплекса цитохрома Р-45 с окисью углерода в микросомах печени крыс Группа животных Положение максимума, нм Интактная 45,4 ±,1 Индуцированная фенобарбиталом Индуцированная 3-метилхолантреном Индуцированная 449,9 ±,2 449, ±,1 447,9 ±,1 Примечание. Результаты представлены в виде среднее ± ошибка среднего. - отличия от интактных животных достоверны (Р .5). Животных, которым вводили, забивали на 3 сутки. Положения максимумов в спектрах поглощения у животных, которым вводили растворители, совпадают с положенями максимумов у интактных животных. 153 Выявленные изменения состояния антиоксидантных ется интенсификация обмена глутатиона систем указывают на то, что (рис. 4). Так, у обоих видов повышается при действии в среднесмертельных активность глутатионредуктазы в дозах у крыс и морских свинок наблюда- цитозоле. Достоверное отклонение активноотносительное содержание глютатиона,% активность глютатион-s-трансферазы,% активность глютатионредуктазы, % активность супероксиддисмутазы, % глютатиона,% активность глютатион-s-трансферазы,% активность глютатионредуктазы, % активность супероксиддисмутазы, % Рис. 4. Влияние воздействия в среднесмертельной дозе на антиоксидантные показатели в печени млекопитающих морская свинка, 2. - крыса нелинейная..2 и.3 - в микросомах ( ) и цитозоле ( ),.4 - в митохондриях ( ) и цитозоле ( ). Данные представлены так же, как на рис сти этого фермента от контроля в данной имеет место с 1 суток и до конца эксперимента. фракции зарегистрировано на 7 сутки Связанная с микросомами актив- интоксикации у крыс и с 1 по 3 сутки у ность глутатионредуктазы у морских свинок морских свинок. Однако активность глутатионредуктазы, практически не меняется. связанная с микросомами, Не меняется у данного вида и существенно повышается только у крыс. активность глутатион-s-трансферазы в Достоверное изменение в последнем случае обеих использованных фракциях, тогда как общих липидов, % триглицеридов, % фосфолипидов, % холестерина, % общих липидов, % триглицеридов, % фосфолипидов, % холестерина, % Рис. 5. Влияние воздействия в среднесмертельной дозе на показатели липидного обмена в сыворотке крови млекопитающих морская свинка, 2. - крыса нелинейная. Данные представлены так же, как на рис у крыс наблюдается существенное последнего вида, токсическое действие повышение активности этого фермента в на особей которого характеризуется обеих фракциях на сутки. Таким выраженным поражением печени по типу образом, изменения исследуемых показателей указывают на интенсификацию крови крыс наблюдается увеличение всех жировой дистрофии [31]. В сыворотке метаболизма глутатиона при интоксикации исследуемых показателей. Уже на. Интенсифицируются при интоксикации и процессы биосинтеза глута- общего содержания липидов и сутки регистрируется повышение тиона, поскольку у обоих видов было триглицеридов, позднее, на 14 сутки, достоверно возрастает содержание зарегистрировано увеличение его содержания печени к 3 суткам в 2,5- холестерина и фосфолипидов. Полная 3, раза. В дальнейшем, к 3 суткам значение этого биохимического показателя нормализация сывороточных липидных возвратилось к норме. показателей крыс происходит к 3 суткам. Наблюдающиеся при интоксикасии Согласно полученным данным, изменения активности СОД интоксикация сопровождается у этого вида также и β-липопротеидемией существенно различаются у крыс и морских свинок (рис. 4). У первых динамика характеризуется снижением, до- 7 суток после введения яда. (рис. 6), которая регистрируется, начиная с стигающим достоверной величины на Морские свинки, поражение 22 сутки от момента введения, как в которых диоксином не сопровождается митохондриях, так и в цитозоле. У вторых, заметными дистрофическими изменениями наоборот, имеет место увеличение в печени, характеризуются и менее активности СОД, наиболее резко выраженной липидемией (рис. 5). У них выраженное в митохондриях на 7 сутки. также наблюдается некоторое увеличение содержания в сыворотке триглицеридов, но Описанные особенности изменения несколько позднее, чем у крыс: на активности фермента защиты от сутки после введения. супероксиданиона на фоне увеличения Повышение содержания холестерина регистрируется у данного вида в течение первых продуцирования этой АФК в микросомах при интоксикации возможно двух недель, а затем значение этого отражают то, что системы защиты от АФК показателя приближается к норме и даже у крыс рассчитаны на противостояние становится ниже контроля на 3 сутки. высокой интенсивности их продуцирования Изменения, сходные с описанными для холестерина, имеют место и по содержанию в в норме и работают с запасом, позволяющим без прироста активности СОД крови фосфолипидов. Однако все отмеченные инактивировать весь образующийся изменения липидных показателей в супероксиданион даже в условиях его сыворотке крови морских свинок после повышенной генерации. В свою очередь, введения диоксина происходят на фоне отсутствия достоверных отклонений в общем морские свинки имеют существенно более низкий уровень продуцирования АФК в содержании липидов. норме и, соответственно, более низкий уровень активности ферментов защиты. В 2 таких условиях у них, по-видимому, 16 сформировался механизм индукции СОД при повышении генерации 12 супероксиданиона, в отличие от крыс, у которых способность к индукции этого 8 фермента, если и есть, то выражена слабо. Вовлечение субстратов и ферментов 4 липидного обмена в биохимический сдвиг, развивающийся в организме при попадании в него диоксина, в частности, мощная индукция Р-45-содержащей ОСФ и активация ПОЛ, приводят к существенным изменениям показателей липидного обмена Рис. 6. Влияние воздействия в сыворотке крови морских свинок и крыс (рис. 5). Наиболее заметны эти изменения у 156 липопротеидов, % в среднесмертельной дозе на содержание β-липопротеидов в сыворотке крови нелинейных крыс. Данные представлены так же, как на рис. 1. Согласно приведенным результатам является прооксидантным. Это отражает экспериментальных исследований, вызываемый биохимический сдвиг ряд косвенных признаков, к как наблюдаемая активация ПОЛ, так и которым Поступление в клетку Взаимодействие с цитозольным рецептором и индукция цитохром Р-45-содержащей ОСФ Взаимодействие с цитохромом Р-45 и разобщение монооксигеназного цикла на фоне снижения пероксидазной активности цитохрома Увеличение образования АФК в эдоплазматическом ретикулуме клетки Устойчивый прооксидантный патобиохимический сдвиг Истощение защитных возможностей клетки от АФК И ПОЛ Окисление липидов Окисление тиоловых и других функциональных групп белков Повреждение ДНК Увеличение проницаемости мембран Разобщение окислительного фосфорилирования Инактивация ферментов Активация фосфолипазы А 2 Падение уровня макроэргов в клетке Увеличение концентрации Ca 2+ в цитоплазме клетки Снижение репаративных возможностей клетки Нарушение структурной целостности клетки Гибель клетки Рис. 7. Схема патобиохимического механизма повреждающего действия на клетку 157 относятся стимуляция обмена глутатиона, механизм окисления субстрата данной повышение активности СОД, сходство монооксигеназой [34]. Согласно выявленных изменений показателей приведенной схеме наряду с включением липидного обмена в сыворотке крови с кислорода в молекулу субстрата имеет наблюдаемыми при интоксикации место разобщение монооксигеназного цикла четыреххлористым углеродом и гиповитаминозе Е [32]. Механизм [1, 34], приводящее к образованию с заметным выходом супероксиданиона или интенсификации ПОЛ заключается, вероятнее всего, в разбалансе образования АФК перекиси водорода в результате распада промежуточных комплексов цитохром цитохром Р-45-содержащей ОСФ и инактивации как самих АФК, так и Р-45-субстрат-кислород разных степеней продуктов инициируемых ими восстановления. Высвобождающийся при свободнорадикальных реакций, в том числе этом фермент-субстратный комплекс опять продуктов ПОЛ. На рис. 7 приводится восстанавливается цитохром Р-45- схема возможного биохимического механизма повреждающего действия диоксина на в монооксигеназном цикле. Показано редуктазой и взаимодействует с кислородом клетку, ориентированная на ключевую также, что кроме образования АФК роль ПОЛ. Согласно этой схеме, окисление разобщение монооксигеназного цикла липидов и тиоловых групп белков при может сопровождаться четырехэлектронным повышенной интенсивности ПОЛ приводят восстановлением с к повышению проницаемости мембран и образованием воды без окисления субстрата инактивации ряда ферментов с последующим снижением эффективности Описанное разобщение моно- [1]. окислительного фосфорилирования и оксигеназного цикла является причиной падению уровня макроэргов в клетке. регистрируемого образования АФК в Повышение проницаемости мембран, как и микросомах печени при окислении как экзогенных, так и эндогенных субстратов. В падение уровня макроэргов, способствует накоплению в плазме ионов Са2+ за счет его то же время известные ферменты, катализирующие реакции утилизации выхода из митохондриальных депо и диффузии из внеклеточной среды вследствие супероксиданиона и перекиси водорода: снижения эффективности кальциевых СОД, каталаза, разные пероксидазы, насосов цитоплазматической мембраны. являются цитоплазматическими и не Это, в свою очередь, создает условия для функционируют непосредственно в активации кальций-зависимой фосфолпазы мембранах эндоплазматического ретикулу- А2 наружной мембраны митохондрий ма. Поэтому образованию АФК цитохром [33]. Обусловленное повышением активности Р-45-содержащей ОСФ в непосредственной фосфолипазы А2 накопление лизофос- близости к ней, на первый взгляд, фолипидов имеет последствия, сходные с противостоят лишь жирорастворимые последствиями интенсификации ПОЛ: антиоксиданты типа α-токоферола, не увеличение проницаемости мембран. Поскольку обеспечивающие высокоэффективной нарастающая деэнергизация защиты от ПОЛ [9, 15]. Однако необходи- клетки и снижение ее репаративных возможностей мую защиту может обеспечить невосстанов- также приводит к нарушеню ленный редуктазой цитохром Р-45, целостности мембран, то в результате создаются который в таком состоянии функционирует условия для их само- как пероксидаза и утилизирует перекись увеличивающихся повреждений, в результате водорода, а также другие гидроперекиси которых клетка теряет структурную [34, 35]. В литературе включение целостность и, в конце концов, гибнет. кислорода в молекулу субстрата Сделанный при анализе экспериментальных цитохромом Р-45 по типу пероксидазной данных вывод об увеличении реакции получило название шунтирования продуцирования активных форм кислорода монооксигеназного цикла [34]. С положением об антиоксидантной роли свободного и снижение пероксидазной активности при воздействии как неметаболизируемого липофильного нелетучего субстрата цитохрома Р-45 согласуется то, что наличие у него пероксидазной активн
Similar documents
View more...
Search Related
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks